Colture Cellulari
L'attività della Facility di Colture Cellulari è finalizzata alla acquisizione, manipolazione, caratterizzazione e criopreservazione di modelli cellulari umani ed animali e/o di sospensioni cellulari derivanti da campioni di sangue periferico, midollo osseo o biopsie tissutali. Per quanto concerne il mantenimento in coltura delle linee cellulari, il lavoro della Facility di Colture Cellulari del CEINGE si basa sull’applicazione delle norme di buona pratica di laboratorio nell’ambito delle colture cellulari quali manipolazione di una sola linea cellulare per volta, osservazione del rate di proliferazione mediante calcolo delle Population Doublings e monitoraggio del mantenimento dell’aspetto morfologico originale di ciascuna linea cellulare.
La Facility di Colture Cellulari del CEINGE Biotecnologie Avanzate di Napoli è in grado di offrire servizi quali erogazione di linee cellulari umane ed animali, criopreservazione di cellule stabilizzate o derivanti da campioni/tessuti freschi, identificazione della presenza di micoplasma in linee cellulari e/o reagenti, eradicazione del micoplasma in linee cellulari, e creazione di modelli cellulari linfoblastoidi a partire da campioni di sangue periferico umano.
SERVIZI
1. Erogazione di linee cellulari
Le linee cellulari che costituiscono la collezione di modelli cellulari del CEINGE possono essere erogate in tre forme: in forma criopreservata, in attiva crescita o come pellet cellulare. Le linee cellulari in forma criopreservata vengono consegnate mediante prelievo fisico delle ampolle congelate delle singole linee cellulari da taniche di azoto liquido. L’erogazione delle linee cellulari in attiva crescita o sotto forma di pellet viene eseguita in seguito a revitalizzazione della linea cellulare, valutazione della conta cellulare e della vitalità cellulare, e mantenimento in coltura della linea stessa. Tutte le linee cellulari erogate sono controllate dal punto di vista: 1) microbiologico mediante saggi di rilevamento del micoplasma; 2) morfologico, con monitoraggi in microscopia; 3) in termini di capacità proliferativa, tramite accurata ed ottimale manipolazione colturale in ottemperanza con le buone pratiche di laboratorio nell’ambito delle Colture Cellulari.
2. Amplificazione, stima della vitalità e della conta cellulare, e criopreservazione di linee cellulari
Linee cellulari continue e primarie umane ed animali possono essere consegnate alla Facility di Colture Cellulari, dove vengono opportunamente amplificate e ne viene definita la conta e la vitalità cellulare. Per il congelamento, i campioni vengono risospesi in appropriate soluzioni di congelamento, portati a -80°C all’interno di specifici supporti che consentono la discesa graduale della temperatura (circa 1°C/minuto) ed infine stoccati in taniche di azoto liquido (-196°C).
3. Ottenimento di cellule mononucleate da sangue periferico e/o da sangue midollare, stima della vitalità e della conta cellulare.
Le cellule mononucleate contenute all’interno di ciascun campione di sangue possono essere separate dal resto delle popolazioni cellulari attraverso l’uso del gradiente di Ficoll-Paque. La componente di cellule mononucleate viene prelevata e ne viene determinata la vitalità e la conta cellulare. A richiesta le cellule così purificate possono essere criopreservate.
4. Criopreservazione di cellule derivanti da sangue periferico e/o da midollo osseo, e/o biopsie tissutali, con valutazione della conta cellulare e vitalità.
La Facility di Colture Cellulari offre il servizio di criopreservazione e crioconservazione di sospensioni cellulari derivanti da campioni di sangue periferico, midollo osseo o da biopsie tissutali. Su tutti i campioni criopreservati e crioconservati vengono preventivamente valutate conta cellulare e vitalità cellulare.
5. Stabilizzazione di linee cellulari continue umane linfoblastoidi con Epstein-Barr Virus (EBV).
Cellule mononucleate da campioni di sangue periferico vengono isolate mediante gradiente Ficoll-Paque e messe in coltura a contatto con il virus di Epstein-Barr. I linfociti B, ospiti naturali del virus di Epstein-Barr, una volta infettati originano segni morfologici caratteristici dell’avvenuto ingresso del virus al loro interno. Le colture sono quindi amplificate fino alla creazione di una linea linfoblastoide stabile, che viene poi criopreservata su richiesta.
6. Saggi di rilevamento del micoplasma in linee cellulari e/o reagenti
La Facility di Colture Cellulari del CEINGE utilizza due tipologie di saggi per svelare la contaminazione da micoplasma in linee cellulari: il saggio bioluminescente e il test colturale su agar.
Il Saggio Bioluminescente rileva in modo rapido eventuali contaminazioni da micoplasma mediante la valutazione del consumo di ATP da parte delle linee cellulari stesse. Infatti, una linea cellulare contaminata da micoplasma è caratterizzata da un maggior consumo di ATP rispetto ad un modello cellulare micoplasma-negativa.
Il Test colturale su agar rileva la contaminazione di differenti specie di micoplasma in linee cellulari mediante allestimento di un doppio braccio colturale: uno in anaerobiosi e l’altro in aerobiosi. Il braccio in anaerobiosi si basa sull’uso di colture su agar solido del sovranatante di linee cellulari potenzialmente contaminate. Parallelamente viene allestita la coltura in brodo che rappresenta il braccio in aerobiosi. Dopo 14 giorni di incubazione, il brodo arricchito di potenziale micoplasma viene trasferito su agar solido per altri 14 giorni. Al termine dei 28 giorni di coltura, questa procedura di rilevamento del micoplasma è in grado di svelare la presenza anche di una sola colonia di micoplasma.
7. Eradicazione del micoplasma in linee cellulari
La linea cellulare micoplasma-positiva viene sottoposta ad un protocollo standardizzato che si basa sull’utilizzo di 5 differenti antibiotici. Al termine dei singoli trattamenti, ciascuna sub-coltura viene mantenuta per 30 giorni in assenza di antibiotico ed infine vengono eseguiti i test di rilevamento del micoplasma (sia test bioluminescente che saggio colturale su agar) per verificare l’efficacia del pannello antibiotico utilizzato.