Proteomica
L'analisi strutturale di peptidi e proteine e l'identificazione di proteine sconosciute sono tra gli aspetti più importanti delle biotecnologie sia per la ricerca di base che applicata. La Facility di Proteomica e Spettrometria di Massa del CEINGE fornisce una serie di servizi analitici altamente tecnologici indirizzati alla caratterizzazione strutturale di peptidi, proteine e glicoproteine basate sull'integrazione di procedure biochimiche classiche con metodologie avanzate di spettrometria di massa. Questi servizi analitici sono raggruppati nelle seguenti categorie:
- servizi di Spettrometria di Massa
- Servizi di Proteomica
Tutti i servizi analitici includono:
- Specifica consulenza per la definizione delle strategie più idonee al conseguimento dell’obiettivo scientifico;
- Interpretazione e comunicazione scritta dei risultati; conservazione dei dati per un triennio;
- Conversione dei dati in un formato adatto alla pubblicazione;
- Una relazione scientifica firmata dal Responsabile della Facility sulle analisi eseguite (su richiesta).
- Accordi specifici potranno essere stipulati per analisi multiple o per numeri elevati di campioni.
Contatti:
Prof.ssa Maria Monti (responsabile scientifico) montimar@unina.it; tel 0039 0813737919
Dr. Simona Celentano (responsabile attività) celentano@ceinge.unina.it; tel 0039 0813737895
Servizi di Spettrometria di massa
Peso Molecolare accurato di Peptidi e Proteine
Determinazione del peso molecolare accurato di peptidi e proteine mediante analisi con tecniche di spettrometria di massa ESI-MS o MALDI-MS. Ove necessario si provvede anche alla desalificazione del campione mediante HPLC.
Peptide mapping, modifiche post-traduzionali e varianti
Completa caratterizzazione di proteine native e ricombinanti, analisi di proteine varianti e di mutanti, identificazione di modifiche post-traduzionali, epigenetiche, maturazione proteolitica e assegnazione dei ponti S-S, ecc. Pre-trattamento dei campioni sia in soluzione che in gel, idrolisi enzimatica, mass mapping
Analisi LC-MS di proteine
Separazione di proteine mediante HPLC e determinazione diretta del loro peso molecolare accurato mediante spettrometria di massa ESI-MS.
Sequenza di Peptidi mediante Spettrometria di Massa Tandem
Separazione di peptidi mediante HPLC o analisi diretta di campioni purificati e determinazione della sequenza mediante esperimenti di spettrometria di massa tandem.
Analisi di Glicoproteine
Completa caratterizzazione delle catene oligosaccaridiche in glicoproteine. Digestione della proteina, “stripping” enzimatico delle glicoforme, profilo MALDI-MS delle glicoforme ed identificazione dei siti di N-glicosilazione.
Analisi di oligonucleotidi, oligosaccaridi, piccole molecole in generale
Analisi di massa MALDI-MS o ESI-MS di oligonucleotidi sintetici o di oligosaccaridi di estrazione e/o sintesi per la determinazione accurata del peso molecolare
Servizi di Proteomica
Separazione di campioni proteici mediante SDS-PAGE
Frazionamento di campioni proteici mediante SDS-PAGE finalizzata alla successiva identificazione delle bande proteiche.
Identificazione di proteine mediante LC-MS/MS
Identificazione di proteine purificate, in soluzione o frazionate mediante metodologie elettroforetiche mono o bidimensionali. Escissione delle bande proteiche, digestione in situ, analisi LC-MS/MS della miscela di peptidi, ricerca in banche dati.
Esperimenti di proteomica differenziale (tipologia “untargeted label free”) associata ad analisi LC-MS/MS per identificazione e quantificazione relativa delle proteine (inclusa analisi statistica)
Identificazione e quantificazione di proteine differenzialmente espresse in linee cellulari o tessuti mediante metodologie di spettrometria di massa tandem secondo l'approccio label free. L'intero contenuto di proteine viene estratto da campioni, digerito con tripsina su fase solida, e sottoposto ad analisi LC-MS/MS utilizzando spettrometri di massa ad alta risoluzione (con analizzatori tipo Orbitrap o Q-ToF). I raw file ottenuti dall’analisi LC-MS/MS sono analizzati con il software MaxQuant per l’identificazione e quantificazione delle proteine. Il “protein groups” ottenuto è sottoposto ad analisi statistica per la determinazione delle proteine significativamente sovra- o sotto-espresse, in accordo con i Fold Changes misurati.
Analisi “targeted” per quantificazione relativa e/o assoluta di proteine mediante MRM
L’estratto proteico viene trattato su opportune cartucce, procedendo con riduzione dei ponti disolfurici, alchilazione dei residui di cisteina, idrolisi con tripsina e sottoposto ad analisi per quantificazione di proteine mediante MRM (Multiple Reaction Monitoring). Per ogni proteina da analizzare verranno selezionati almeno due peptidi proteotipici (ovvero specifici) mediante l’utilizzo del software Skyline che fornisce un elenco dei migliori peptidi candidati come standard per questo tipo di analisi, le migliori transizioni virtuali (ione molecolare-ione frammento) e l’energia di collisione per generare la massima resa di frammentazione. L’analisi MRM sarà condotta monitorando le transizioni specifiche dello ione molecolare e dei singoli frammenti per ogni peptide selezionato, utilizzando un sistema ifenato costituito dal nanoHPLC accoppiati a spettrometri di massa a triplo quadrupolo. La quantificazione delle proteine potrà essere di tipo relativo o anche determinata in maniera assoluta. In quest’ultimo caso verrà ottenuta mediante interpolazione con le rette di calibrazione costruite a partire da peptidi sintetici identici a quelli individuati dall’analisi Skyline per il monitoraggio della proteina. I peptidi selezionati potranno essere acquistati anche in forma marcata (con C13 o N15) ed impiegati come standard interno per procedure di normalizzazione.
Servizi di Interattomica
Analisi di interazioni tra biomolecole o biomolecole e ligandi generici attraverso Surface Plasmon Resonance
Attraverso l’immobilizzazione della biomolecola di interesse su chip opportunamente derivatizzati, ed incubazione con il/i potenziali ligandi, si andrà a misurare la variazione dell’indice di rifrazione superficiale; questi cambiamenti sono direttamente proporzionali alla massa legata al biosensore che ovviamente varia in presenza di una interazione. Dalle misure diffrattometriche è possibile estrapolare, in opportune condizioni sperimentali, costanti termodinamiche e cinetiche che caratterizzano l’interazione. Le biomolecole e i ligandi da testare devono essere forniti dal committente.
Purificazione delle proteine mediante esperimenti di cromatografia di affinità e/o immunoprecipitazione (Interattomica)
Esperimenti in batch finalizzati alla purificazione di specifiche proteine e/o di complessi proteici utilizzando procedure di affinità (es: his-tag based, o affinità per specifici ligandi) oppure strategie di immunoprecipitazione. Il setting sperimentale e i materiali specifici per la proteina da purificare verranno forniti dal cliente. La procedura prevede lisi cellulare, pre-cleaning in assenza di anticorpo, immunoprecipitazione e verifica western blot della presenza della proteina esca
PUBBLICAZIONI
Spettrometria di massa
S-Glutathionylation at Cys328 and Cys542 Impairs STAT3 Phosphorylation | ACS Chemical Biology
June 18, 2014 -ACS Chemical Biology
S-Glutathionylation at Cys328 and Cys542 Impairs STAT3 Phosphorylation
Elena Butturini, Elena Darra, Giulia Chiavegato, Barbara Cellini, Flora Cozzolino, Maria Monti, Piero Pucci, Daniele Dell’Orco, and Sofia Mariotto
S-glutathionylation exerts opposing roles in the regulation of STAT1 and STAT3 signaling in reactive microglia - ScienceDirect
February 3, 2018 -Free Radical Biology and Medicine
S-glutathionylation exerts opposing roles in the regulation of STAT1 and STAT3 signaling in reactive microglia
Elena Butturini, Flora Cozzolino, Diana Boriero, Alessandra Carcereri de Prati, Maria Monti, Michele Rossin, Diana Canetti, Barbara Cellini, Piero Pucci, Sofia Mariotto
Proteomica
Proteomic signature profiling in the cortex of dairy cattle unravels the physiology of brain aging
Front Aging Neurosci. 2023 Dec 7
Cozzolino F, Canè L, Gatto MC, Iacobucci I, Sacchettino L, De Biase D, Di Napoli E, Paciello O, Avallone L, Monti M*, d'Angelo D, Napolitano F.
Lysosome purinergic receptor P2X4 regulates neoangiogenesis induced by microvesicles from sarcoma patients | Cell Death & Disease (nature.com)
August 17, 2021 -Cell Death & Disease
Lysosome purinergic receptor P2X4 regulates neoangiogenesis induced by microvesicles from sarcoma patients
Wulf Palinski, Maria Monti, Rosa Camerlingo, Ilaria Iacobucci, Serena Bocella, Federica Pinto, Clara Iannuzzi, Gelsomina Mansueto, Sara Pignatiello, Flavio Fazioli, Michele Gallo, Laura Marra, Flora Cozzolino, Annarosaria De Chiara, Piero Pucci, Antonio Bilancio & Filomena de Nigris
Biomolecules | Free Full-Text | What Antarctic Plants Can Tell Us about Climate Changes: Temperature as a Driver for Metabolic Reprogramming (mdpi.com)
July 23, 2021-Biomolecules
What Antarctic Plants Can Tell Us about Climate Changes: Temperature as a Driver for Metabolic Reprogramming
Laura Bertini, Flora Cozzolino, Silvia Proietti, Gaia Salvatore Falconieri, Ilaria Iacobucci, Rosanna Salvia, Patrizia Falabella, Maria Monti, Carla Caruso
Therapeutic targeting of Lyn kinase to treat chorea-acanthocytosis | Acta Neuropathologica Communications | Full Text (biomedcentral.com)
May 3, 2021-Acta Neuropathologica Communications
Therapeutic targeting of Lyn kinase to treat chorea-acanthocytosis
Kevin Peikert, Enrica Federti, Alessandro Matte, Gabriela Constantin, Enrica Caterina Pietronigro, Paolo Francesco Fabene, Paola Defilippi, Emilia Turco, Federico Del Gallo, Pietro Pucci, Angela Amoresano, Anna Illiano, Flora Cozzolino, Maria Monti, Francesca Garello, Enzo Terreno, Seth Leo Alper, Hannes Glaß, Lisann Pelzl, Katja Akgün, Tjalf Ziemssen, Rainer Ordemann, Florian Lang, Anna Maria Brunati, Lucia De Franceschi
Proteome alterations in erythrocytes with PIEZO1 gain-of-function mutations | Blood Advances | American Society of Hematology (ashpublications.org)
JANUARY 3, 2023-blood advances
Proteome alterations in erythrocytes with PIEZO1 gain-of-function mutations
Immacolata Andolfo, Vittoria Monaco, Flora Cozzolino, Barbara Eleni Rosato, Roberta Marra, Vincenza Cerbone, Valeria Maria Pinto, Gian Luca Forni, Sule Unal, Achille Iolascon, Maria Monti, Roberta Russo
Interattomica
Enzyme Replacement Therapy for FABRY Disease: Possible Strategies to Improve Its Efficacy.
Int J Mol Sci. 2023 Feb 25;
Iacobucci I, Hay Mele B, Cozzolino F, Monaco V, Cimmaruta C, Monti M*, Andreotti G, Monticelli M.