Come affrontare la fase autunnale: le proposte degli esperti del CEINGE-Biotecnologie avanzate

Una diagnosi accurata è fondamentale nel controllare la pandemia e nella comprensione dell'epidemiologia della malattia, soprattutto in un momento in cui il mercato della diagnostica risulta saturo di prodotti diagnostici alternativi (attualmente circa 250), alcuni dei quali spesso rilasciati sul mercato dopo una procedura di validazione in urgenza (EUA) ed in assenza di lavori di comparazione metodologica, fondamentali, invece, ai fini della validazione clinica oltre che analitica del test.

E’ importante, quindi, fare il punto sui limiti ed i vantaggi derivanti dall’impiego dei numerosi prodotti commerciali. In considerazione del fatto che, al di là dei casi sospetti o clinicamente sintomatici, la WHO definisce come caso confermato “una persona con test di laboratorio positivo per infezione da SARS-CoV-2, indipendentemente dai segni e sintomi”, è oltremodo necessario mettere a disposizione della popolazione e dei Sistemi sanitari strumenti sempre più affidabili, oltre che rapidi, per garantire un adeguato percorso diagnostico di laboratorio. In Italia il numero di contagi sembra in progressivo aumento e la necessità di indagini è significativamente aumentata (quasi raddoppiata in alcuni giorni ed in alcune regioni) visto il rientro da Paesi a rischio ed il contatto con persone non messe in quarantena in modo tempestivo, ed è presumibile che aumenterà ancora con il rientro scolastico e l’approssimarsi della comune sindrome influenzale.

E’ importante, perciò, definire quali sono i limiti che gli attuali test diagnostici presentano, al fine di migliorare ed armonizzare le strategie diagnostiche COVID-19.

L’utilizzo di test diagnostici accurati è fondamentale per l'identificazione dei casi in tempi rapidi, ma anche dei contatti che devono essere messi in quarantena e guidati in base alle esigenze epidemiologiche correlate alla pandemia. La scelta del campione pertinente e la conoscenza del periodo di incubazione, della viremia e del periodo di diffusione sono importanti nella diagnosi di casi individuali e nella definizione della trasmissibilità per informare le autorità sul periodo di isolamento dei pazienti.

Secondo l’OMS:

1. il test su acido nucleico RNA del virus (molecolare) è consigliato per la diagnosi di casi acuti,
2. i test sierologici (anticorpi IgG, IgM e/o antigene) hanno un ruolo importante nelle valutazioni epidemiologiche per determinare il tasso di infezione e stabilire l'immunità di individui che sono guariti, ma non sono rilevanti per la diagnosi di casi acuti.

Riguardo alla tipologia di campioni da esaminare, i campioni consigliati per la diagnosi di casi acuti per RT-PCR (ad oggi, diversi test CE-IVD validati, rilevano 2 geni virali contemporaneamente, altri 3 o 4 geni virali) sono quelli delle vie respiratorie superiori o inferiori: tamponi nasofaringei (NF) e orofaringei (OF) o in pazienti ambulatoriali e/o espettorato (se prodotto) e/o aspirato endotracheale o lavaggio bronco-alveolare in pazienti con malattie respiratorie o polmonari più gravi. Ai fini medico-legali ed epidemiologico è possibile utilizzare tessuto post-mortem.

Effettuare il test molecolare su campioni da più siti (vie respiratorie superiori ed inferiori) può migliorare la sensibilità della RT-PCR e ridurre il numero dei falsi negativi, in particolare nella seconda settimana di malattia. 

Può essere utile anche un campionamento ripetuto per monitorare la clearance virale ma non è essenziale per tutti i protocolli di uscita dall’isolamento (corrispondente alle 2 settimane o almeno 10 giorni di quarantena). Considerando che il periodo mediano di incubazione è di quattro giorni (range 3-8 giorni), la raccomandazione attuale dell'OMS per la sorveglianza dei pazienti con COVID-19 o degli individui esposti è di 14 giorni, sebbene la diffusione prolungata dell'RNA possa verificarsi fino al giorno 37 in alcuni pazienti. Secondo un documento del Centro Europeo per la Prevenzione delle Malattie e Controllo (ECDC), la presenza o la dispersione dell'RNA virale di SARS-CoV-2 non è sinonimo di infettività, a meno che non vi sia la prova che il virus possa essere isolato e coltivato ​​dai campioni prelevati.

La disponibilità di test diagnostici rispetto alla capacità di eseguire l’isolamento del virus può influenzare la decisione di porre fine all'isolamento; la correlazione, però, tra l'eliminazione dell'RNA e l'infettività richiede ulteriori indagini e necessita ancora di approfondimenti scientifici.

E’ necessario, comunque, inattivare il campione e questo può inficiare, soprattutto quando si usano procedure basate sullo shock termico, in modo significativo la qualità del dato.

Nessun metodo è indenne da limitazioni pre-analitiche e post-analitiche e gli aspetti di messa a punto metodologica vanno affidati sempre a laboratori qualificati e certificati con esperienza documentata.

Recentemente è stato pubblicato un lavoro che confronta le singole coppie di primer e sonde molecolari, per il rilevamento del virus, suggerendo che, sebbene tutti i kit rilevano il virus, ci sono alcune differenze di sensibilità e specificità. Alcuni sistemi hanno anche mostrato cross-reattività con altri target molecolari. Poiché tutti i test attualmente necessitano sempre di un test di conferma, questi problemi potrebbero non influire sulle diagnosi accurate di SAR-CoV-2. Tali limitazioni, tuttavia, dovrebbero essere tenute presenti quando si sceglie uno specifico sistema di dosaggio e richiede ulteriori indagini valutative prima della messa a regime in routine.  Al fine di facilitare la disponibilità di test, però, la FDA americana ha approvato numerosi prodotti diagnostici commerciali con procedura di emergenza (EUA). L’approvazione EUA richiede che le Aziende definiscano il limite di rilevamento-sensibilità analitica (limit of detection) del loro dosaggio SARS-CoV-2 e dimostrino il rilevamento del 100% delle sequenze SARS-CoV-2 con i primer del saggio e sonde pubblicate in letteratura. I test approvati sono per lo più test RT-PCR realtime, eseguibili in modalità manuale o su piattaforme commerciali automatizzate.

Due sono i punti su cui si basa la scelta del miglior kit diagnostico:

1. affidabilità e sensibilità analitica del prodotto,
2. velocità di esecuzione del test.

Abbott Diagnostics ha recentemente messo in commercio un rapido saggio molecolare in tempo reale che può produrre un risultato positivo entro 5 minuti ed un risultato negativo entro 13 minuti. E’ un test molecolare point of care (POC) per i casi acuti che possono essere eseguiti nello studio del medico. Una eventuale positività va, comunque e sempre, confermata con test canonico in RT-PCR in laboratori qualificati e certificati con esperienza documentata.

Anche per quanto riguarda i test rapidi, l’OMS attualmente raccomanda di far effettuare la diagnosi di COVID-19 da laboratori che utilizzano test molecolari mirati alla ricerca dell’RNA del virus SARS-CoV-2. Ciò garantisce che i risultati di laboratorio possano identificare correttamente i pazienti per l'isolamento ed il trattamento nonché per monitorare la pandemia. A causa delle attuali limitazioni delle infrastrutture e della carenza di forniture, che limitano la capacità di accesso a test diagnostici rapidi affidabili, sono in valutazione test rapidi che ricercano l’antigene per espandere la capacità di effettuare test da parte dei laboratori e per soddisfare le esigenze mediche e di prevenzione della salute pubblica. L'ECDC ha recentemente pubblicato una revisione dei test rapidi: secondo la definizione ECDC, i test rapidi sono sistemi di diagnostica in vitro di tipo qualitativo o semi-quantitativo che richiedono piccole o singole quantità di campione. Sono, in generale, procedure non automatizzate progettate per fornire risultati entro 10-20 minuti anziché in ore, come nel caso dei test molecolari, e possono essere eseguiti in laboratorio o in modalità point of care. Di solito, si tratta di test diretti al rilevamento dell’antigene o test anticorpali indiretti. L'ECDC sta lavorando in stretta collaborazione con la Commissione Europea, le Autorità degli Stati membri e l'OMS sulla convalida dei test rapidi e renderà disponibili i risultati il ​​prima possibile sul sito. In questo contesto si sottolinea come, tuttavia, i test rapidi degli anticorpi non sono indicati per la diagnosi di casi clinici se usati da soli.

Va segnalato anche che, sebbene i test basati sul rilevamento rapido degli antigeni possano rilevare il virus nelle prime fasi dell'infezione, questi possono avere limitazioni relative alla sensibilità rispetto ai test di amplificazione degli acidi nucleici e possono anche presentare fenomeni di reazione crociata con altri coronavirus. Quest’ultimo aspetto limita anche i saggi anticorpali indiretti che, pertanto, non sono utili per diagnosi precoce di casi clinici, ma possono esserlo per determinare l'immunità individuale o di gregge o per finalità di tipo epidemiologico.

Vale la pena di rimarcare e ricordare che i moltissimi kit sierologici sul mercato sono ancora in fase di validazione definitiva, essendo stati approvati in modalità EUA.

La validazione, pertanto, dei sistemi adottati, così come per i test, resta una priorità assoluta per ciascun laboratorio attraverso una accurata valutazione di sensibilità e specificità, molecolare e sierologica. Questo approccio è considerato dall’OMS come una priorità assoluta per portare la pandemia sotto controllo.

In tale contesto ancora non libero da incertezze, il CEINGE ritiene che si debba procedere ad un cambio di impostazione delle campagne di screening, utilizzando prevalentemente test rapidi che ricercano l’antigene da accoppiare a test molecolari standard per avere la conferma di positività. Questo tipo di modello è sicuramente in grado di generare risparmi, in termini di costi-benefici, perché eliminerebbe il ricorso ai dosaggi rapidi o in chemiluminescenza degli anticorpi, e permetterebbe di escludere dai test molecolari una quota di pazienti negativi che generano il collo di bottiglia per i laboratori delle reti diagnostiche regionali (riducendo i ritardi nella consegna dei referti e mantenendo, a volte, in uno stato di disagio intere famiglie sottoposte allo screening). L’elevata sensibilità di questi test rapidi permette di escludere dallo screening molecolare, con un ragionevole grado di certezza, i soggetti sicuramente “non affetti”: considerando che i test rapidi attualmente in fase di valutazione vantano un 95% di sensibilità analitica, questo permetterebbe di concentrare l’analisi solo sul 5% dei soggetti sottoposti a screening rapido che dovessero risultare positivi o con test dubbio. Considerando che il costo di uno dei test più accreditati basati sull’antigene è di circa 5 €, per un totale di 15-20 €, (contro i 30 € medi, per un totale di 60-65 €, di un test canonico, sierologico o molecolare), questo porterebbe un enorme risparmio nella gestione dello screening di popolazione ed accelererebbe il monitoraggio, offrendo un quadro più ampio sulla reale circolazione del virus nelle comunità.   

Alla luce delle considerazioni fin qui fatte, il CEINGE ha avviato percorsi di validazione interna dei diversi sistemi commerciali ai fini della valutazione delle performance analitiche dei seguenti strumenti diagnostici disponibili:

1. TEST RAPIDO, basato sull’antigene, su tampone o sulla saliva (pochi minuti);
2. TEST MOLECOLARE RAPIDO (circa 13 minuti) per la conferma del test antigenico (soprattutto per reparti di area critica o Pronti Soccorso o per situazioni di emergenze/urgenza diagnostica);  
3. TEST MOLECOLARE CLASSICO, con il rilevamento di 3 - 4 geni virali (circa 5 ore inclusa la estrazione dell’RNA virale da tampone);
4. TEST COMBINATO, SARS-CoV-2 + Virus Influenza A e B (FluA e FluB) + RSV (virus respiratori) in modo da distinguere tra COVID-19 ed altre infezioni da virus influenzali tipiche dell’autunno-inverno. Questo particolare test sarebbe di enorme vantaggio soprattutto ai fini del miglioramento della gestione delle procedure di isolamento che, di fronte ad un risultato dubbio o falsamente positivo, verrebbero messe in atto, ad esempio nelle scuole o nei posti di lavoro, creando non pochi disagi alla comunità. E’ presumibile che con il ricorso ad un test unico, combinato, che impiega lo stesso tempo del test classico molecolare per SARS-CoV-2, si avrà un alleggerimento delle attività di monitoraggio e contenimento della pandemia.

Alla luce dei risultati che si otterranno da tali percorsi di valutazione, il CEINGE (che attualmente impiega kit in grado di rilevare dai 3 ai 4 geni virali) proporrà agli Organi Istituzionali di attuare un percorso diagnostico che preveda l’impiego di tecnologie integrate al fine di migliorare le strategie di rilevamento virale, riducendo tempi e costi di esecuzione.