Microscopia

La Facility di Advanced Light Microscopy del CEINGE ha un’attrezzatura all’avanguardia e offre agli utenti interni ed esterni al CEINGE un supporto nella scelta delle tecniche di microscopia più appropriate per perseguire i propri obiettivi scientifici, nonchè un aiuto esperto nella progettazione degli esperimenti, nell’utilizzo dei microscopi e nell’analisi dei risultati ottenuti. A breve la Facility fornirà anche un servizio di preparazione dei campioni per l’utilizzo della microscopia a super-risoluzione, sia su campioni di tessuto che di cellule.  

La Facility, per la quale è in corso un’implementazione da completare entro il 2020, ospita una varietà di sistemi che vanno da stereo di base a microscopi a fluorescenza wide-field, a due confocali (di cui uno dotato di super-risoluzione), oltre a programmi di visualizzazione ed elaborazione delle immagini, e analisi dei dati:

• Microscopia a luce trasmessa (campo chiaro e contrasto di fase), per la valutazione della morfologia generale di cellule e tessuti
• Microscopia a fluorescenza, per l’analisi della distribuzione di marcatori fluorescenti in cellule e tessuti
• Stereomicroscopia a luce trasmessa (in campo chiaro, campo scuro unilaterale e contrasto Rotterman) e a fluorescenza, per studiare la morfologia e valutare la distribuzione di marcatori fluorescenti in piccoli animali da laboratorio, embrioni e tessuti tridimensionali
• Microscopia confocale, per studiare co-localizzazioni tra proteine e la loro distribuzione nelle tre dimensioni dello spazio (3D)
• Microscopia in super-risoluzione (STED, Stimulated emission depletion) per discriminare strutture cellulari e interazioni proteiche con una risoluzione che può raggiungere i 50nm in xy e i 130nm in z
• FRET (Fluorescence resonance energy transfer) per valutare la forza e la distribuzione cellulare delle interazioni proteiche, e monitorare le dinamiche intracellulari di proteine e piccole molecole
• FRAP (Fluorescence recovery after photobleaching) e FLIP (Fluorescence Loss In Photobleaching) per studiare gli scambi molecolari tra organelli, la mobilità proteica tra differenti regioni cellulari e le cinetiche di legame tra proteine
• Software per analisi di immagini e quantizzazione dei segnali fluorescenti (ImageJ, Cell Profiler, LasAF, LasX)

I microscopi attualmente presenti presso la facility sono:

• Microscopio confocale Leica TCS SP8 STED 3x
• Microscopio confocale Leica TCS SP5
• Microscopio invertito a fluorescenza Leica DMI4000B
• Stereomicroscopio a fluorescenza Leica M 205 FA

In particolare entrambi i microscopi confocali Leica TCS SP5 e TCS SP8 STED 3x sono dotati di un sistema per la separazione spettrale (PRISMA OTTICO) che permette di selezionare per ciascun canale lo spettro di emissione in modo continuo ed individuale, consentendo di ottimizzare sperimentalmente la migliore emissione del preparato. Inoltre entrambe le apparecchiature dispongono di un dispositivo acusto-ottico (AOBS) per la selezione delle lunghezze d’onda in eccitazione/emissione programmabile, in grado di ridurre al minimo il crosstalk di segnali ad alte velocità di acquisizione.

Il microscopio Leica TCS SP8 STED 3x dispone anche di un LASER BIANCO, che genera luce nell’intervallo delle lunghezze d’onda compreso tra i 470 e i 670nm, consentendo l’eccitazione dei fluorocromi sul picco di massima espressione, per ottimizzare il segnale in emissione con un minore utilizzo di energia e ridotto photobleaching. Grazie all’uso sinergico di questo laser con il sistema AOBS, si possono utilizzare contemporaneamente fino ad 8 linee di laser. Inoltre la presenza di 2 fotorilevatori HyD permette di raggiungere una maggiore sensibilità ed ottenere un migliore contrasto, oltre a consentire un più accurato conteggio di fotoni, richiesto per la quantificazione dei segnali fluorescenti. Infine il tavolino traslatore X/Y motorizzato ultrapreciso (X/Y Scanning Stage) permette l’acquisizione di campioni di grandi dimensioni ad alto ingrandimento, grazie alla funzione “mosaico”.

In aggiunta a questi elementi il microscopio Leica TCS SP8 STED 3x è dotato di un sistema di super-risoluzione, che grazie alla combinazione con il Laser Bianco ed i fotorilevatori HyD, permette lo sviluppo della tecnica di gated STED (gSTED), che arriva ad una risoluzione <50nm in xy e <130nm in z. Questo sistema, differentemente da altri sistemi di super-risoluzione, non richiede un processamento dell’immagine successivo all’acquisizione e quindi si presenta notevolmente più veloce. Inoltre esso consente di analizzare anche campioni più spessi, permettendo di acquisire fino a 20um in z-stack.

Il personale della facility potrà essere contattato per discutere le finalità dell’esperimento che si intende eseguire, al fine di ricevere indicazioni sul disegno sperimentale nonché sulla tecnica e sullo strumento più idonei per i propri scopi. Gli utenti interni all’istituto possono inoltre richiedere corsi di formazione che consentano l’abilitazione all’uso indipendente degli strumenti.

Regolamento

Gli utenti esterni al CEINGE che intendono avvalersi dei servizi offerti dalla facility di Advanced Light Microscopy dovranno preventivamente contattare il personale della facility (romanoa@ceinge.unina.it) per concordare il tipo di servizio più idoneo ai propri scopi ed ottenere un’offerta formale. Prima di accedere al servizio l’utente dovrà provvedere all’emissione di un ordine ufficiale, da inviare all’amministrazione del CEINGE (fernicola@ceinge.unina.it).